也就是说，俾斯麦有三个月时间来挑起与奥地利的战争。他已经做好了准备。自腓特烈大帝以来，普奥双方总是不可避免地存在冲突，如今它们迎来了最终的较量。
其实早在1863年，奥地利提出要所有诸侯国君主和自由市齐聚法兰克福，大家一起商讨德意志邦联的改革以及如何实现德意志的统一大业，唯有普鲁士国王威廉一世拒绝了这一邀请，但这并非他所愿，而是因为俾斯麦坚持“奥地利的改革方法并不符合普鲁士王室的地位与德意志人民的利益”。普鲁士拒绝奥地利的邀请，就意味着要挑战奥地利的权威，只是当时石勒苏益格-荷尔斯泰因问题更加急迫，所以推迟了冲突爆发的时间。到了1866年，这场冲突再也推迟不了了，普鲁士与意大利的协议也不允许再推迟。加施泰因会议的价值如今显现了出来。普奥双方的分歧再次出现。俾斯麦提出抗议，表示奥地利的做法相当于鼓励奥古斯滕堡家族夺取荷尔斯泰因。普军因此进入荷尔斯泰因，逼迫奥地利撤军并向邦联求助。俾斯麦谴责邦联，认为这个组织就是德意志软弱的根本原因。6月14日，邦联议会同意动员邦联军队对抗普鲁士，同日普鲁士正式退出邦联，并于次日（6月15日）向萨克森、汉诺威以及黑森宣战。6月18日，普鲁士又向邦联内包括奥地利在内的其他成员国宣战。
这场战争虽然短暂，但极其激烈。不到六个星期的时间，普鲁士就把奥地利甚至整个德意志踩在了脚下。到了6月18日，普军便占领了汉诺威、黑森和萨克森。汉诺威军队虽然一开始在朗根萨尔察获得了胜利，但是到了28日，也向沃格尔·冯·法尔肯施泰因将军投降。汉诺威的投降书宣示汉诺威王国覆灭以及被并入了普鲁士。