長期以來，人們對亞曆山大的死因有不斷的猜測和爭議。大多數曆史資料記載，亞曆山大在巴比倫的一次痛飲後，得了瘧疾，除此之外，傷寒也可能是另外一個凶手。還有理論認為他死於嚏根草中毒，密謀者可能包括他的妻子羅克珊娜，他的部將安提帕特以及他的老師亞裏士多德。但是下毒的理論被Robin Lane Fox（《亞曆山大傳》的作者）所質疑，因為當時的古希臘缺乏作用時間長的毒藥。
美國疾病控製和預防中心在2004年7月號《新型傳染疾病》雜誌裏刊登了幾篇論文，討論了“亞曆山大死於西尼羅河病毒”的說法。
亞曆山大並未留下帝位的合法繼承者，與他最親近的是一位昏弱無能的異母兄弟。傳說，當他的朋友在他臨死前要求他指定一位繼承人時，他含糊地說：“讓最強者繼承。”於是他死後，他的將領們企圖瓜分這個帝國，引發了一些年輕軍官對這種安排的不滿，繼而發生一連串的戰爭，在這場鬥爭中，亞曆山大的母親、妻子和孩子都橫遭殺身之禍。
亞曆山大死後，他的帝國被部下們繼承和分裂。開始還保持了帝國形式上的統一，不久統治各塊領地的首領們就陷入公開的爭鬥。最終，他們於公元前301年在弗裏基亞的伊浦蘇斯之役後結束了爭鬥。由3位勝利者托勒密、塞琉古、安提柯一世（獨眼）瓜分了亞曆山大帝國的版圖，開啟了希臘化時代。除了馬其頓本土和最遠的印度以外，亞洲部分由部將塞琉古繼承，這就是後世和羅馬的龐培、克拉蘇等征戰不休的塞琉古帝國。埃及由部將托勒密繼承，這就是埃及的托勒密王朝，直傳到後世和愷撒結婚的埃及豔後克莉奧佩特拉為止。
亞曆山大的遠征使希臘文明在中東和中亞繁盛發展，以及大夏——犍陀羅藝術在印度次大陸的發展，在文化上也產生了深遠的影響。