长期以来，人们对亚历山大的死因有不断的猜测和争议。大多数历史资料记载，亚历山大在巴比伦的一次痛饮后，得了疟疾，除此之外，伤寒也可能是另外一个凶手。还有理论认为他死于嚏根草中毒，密谋者可能包括他的妻子罗克珊娜，他的部将安提帕特以及他的老师亚里士多德。但是下毒的理论被Robin Lane Fox（《亚历山大传》的作者）所质疑，因为当时的古希腊缺乏作用时间长的毒药。
美国疾病控制和预防中心在2004年7月号《新型传染疾病》杂志里刊登了几篇论文，讨论了“亚历山大死于西尼罗河病毒”的说法。
亚历山大并未留下帝位的合法继承者，与他最亲近的是一位昏弱无能的异母兄弟。传说，当他的朋友在他临死前要求他指定一位继承人时，他含糊地说：“让最强者继承。”于是他死后，他的将领们企图瓜分这个帝国，引发了一些年轻军官对这种安排的不满，继而发生一连串的战争，在这场斗争中，亚历山大的母亲、妻子和孩子都横遭杀身之祸。
亚历山大死后，他的帝国被部下们继承和分裂。开始还保持了帝国形式上的统一，不久统治各块领地的首领们就陷入公开的争斗。最终，他们于公元前301年在弗里基亚的伊浦苏斯之役后结束了争斗。由3位胜利者托勒密、塞琉古、安提柯一世（独眼）瓜分了亚历山大帝国的版图，开启了希腊化时代。除了马其顿本土和最远的印度以外，亚洲部分由部将塞琉古继承，这就是后世和罗马的庞培、克拉苏等征战不休的塞琉古帝国。埃及由部将托勒密继承，这就是埃及的托勒密王朝，直传到后世和恺撒结婚的埃及艳后克莉奥佩特拉为止。
亚历山大的远征使希腊文明在中东和中亚繁盛发展，以及大夏——犍陀罗艺术在印度次大陆的发展，在文化上也产生了深远的影响。
这么一个才智过人的伟大人物，去世后却留下了许多不解之谜。亚历山大石棺被窃，迄今下落不明；亚历山大为何没有指定合法继承者，使得马其顿帝国迅速瓦解；他爱护和慰藉俘虏的敌人，却凶暴残忍，亲手杀死了亲密朋友和救命恩人。
后人这样评价亚历山大：亚历山大是历史上最富有戏剧性的人物，他的经历和个性一直是力量的源泉。作为战士，他智勇双全；作为将军，他无与伦比。在十多年的奋战中，他从未打过一次败仗。
然而，他还是亚里士多德的弟子，是一位智慧非凡的人。他珍爱荷马的诗歌。他认识到了非希腊人不一定是野蛮人，这确实表现出他远比当时的大多数希腊思想家更具有远见卓识。
一般认为，亚历山大是位颇受人喜爱的人物。同拿破仑一样，亚历山大对他的同代人有着极其广泛的影响。从长远来看，亚历山大征服所带来的最重要的影响，是使希腊和中东的开化民族开始相互密切往来，因此，极大地丰富了这两个民族的文化。
亚历山大在世期间及其死后不久，希腊文化迅速传入伊朗、美索不达米亚、叙利亚、竹地尔和埃及；而亚历山大执政以前的希腊文化仅以缓慢的速度传入这些地区。亚历山大还把希腊的影响波及以前从未到达的印度和中亚地区。文化的影响绝不是单向传播的事，在希腊文化时代（亚历山大征服后的几百年间），东方思想，特别是东方宗教思想就已传入希腊世界。就是这种希腊文化——主要指具有希腊特征但也深受东方影响的文化，最终对罗马产生了影响。
亚历山大在其征战生涯中，建立了20多座城市。其中最著名的是埃及亚历山大市，它很快便成为当时世界主要的城市之一，一个著名的学术和文化中心。还有几个城市如阿富汗的赫拉特和坎大哈也发展为重要的城市。
作为当时马其顿帝国埃及行省的总督所在地，亚历山大大帝死后，埃及总督托勒密在亚历山大建立了托勒密王朝，加冕为托勒密一世。亚历山大成为埃及王国的首都，并很快就成为古希腊文化中最大的城市。在西方古代史的记载中其规模和财富仅次于罗马，但埃及的伊斯兰教统治者，确定了开罗为埃及的新首都后，亚历山大市的地位不断下降，在奥斯曼帝国末期，它几乎沦为一个小渔村。但纵观历史，亚历山大是古代欧洲与东方贸易的中心和文化交流的枢纽，第二次世界大战后发展迅速，现为世界著名的棉花市场，也是埃及重要的纺织工业基地。